Malkovich nacque a Christopher, nell'Illinois, e crebbe a Benton, sempre nell'Illinois. Suo padre, Daniel Leon Malkovich, era direttore statale per la conservazione ambientale ed editore di Outdoor Illinois, una rivista di tematica. Sua madre, Joe Anne, era proprietaria del Benton Evening News e di Outdoor Illinois.
Nel 1976, Malkovich, insieme a Joan Allen, Gary Sinise e Glenne Headly, divenne membro fondatore della Steppenwolf Theatre Company di Chicago. Si trasferì a New York nel 1980 per recitare in una produzione della Steppenwolf dell'opera teatrale di Sam Shepard "True West", per la quale vinse un premio Obie.
All'inizio del 1982, recitò in "Un tram che si chiama desiderio" con il Wisdom Bridge Theatre di Chicago. Malkovich diresse poi una coproduzione dello Steppenwolf, la riedizione del 1984 di "Balm in Gilead" di Lanford Wilson, per la quale ricevette un secondo Obie Award e un Drama Desk Award. Il suo debutto a Broadway quello stesso anno fu nel ruolo di Biff in "Morte di un commesso viaggiatore" al fianco di Dustin Hoffman nei panni di Willy. Malkovich vinse un Emmy Award per questo ruolo quando l'opera fu adattata per la televisione dalla CBS nel 1985.
Ha fatto il suo debutto cinematografico nel 1984 interpretando il signor Will, l'inquilino cieco di Sally Field in "Places in the Heart". Per la sua interpretazione del signor Will, Malkovich ha ricevuto la sua prima nomination all'Oscar come miglior attore non protagonista. Ha anche interpretato Al Rockoff in "The Killing Fields".
Continuò a lavorare con regolarità in film come L'impero del sole, diretto da Steven Spielberg, e l'adattamento cinematografico del 1987 de Lo zoo di vetro di Tennessee Williams, con Paul Newman e Joanne Woodward.
Malkovich ha interpretato Lennie nell'adattamento cinematografico del 1992 del pluripremiato romanzo breve di John Steinbeck "Uomini e topi", al fianco di Gary Sinise nel ruolo di George. Nel 1994, ha ricevuto un'altra nomination all'Oscar, nella stessa categoria, per "Nel centro del mirino". Sebbene interpretasse il ruolo principale nel film "Essere John Malkovich", scritto da Charlie Kaufman, il suo personaggio era una leggera variante di se stesso, come indicato dal secondo nome del personaggio, "Horatio".
Malkovich ha poi virato bruscamente verso la fantascienza, interpretando Humma Kavula nell'attesissimo adattamento cinematografico del classico romanzo di Douglas Adams "Guida galattica per gli autostoppisti" (2005), per poi virare verso la commedia nera, interpretando un analista della CIA pomposo e spesso ubriaco che si ritrova invischiato in un folle piano di estorsione nel controverso film dei fratelli Coen "Burn After Reading" (2008).
Si è chiaramente divertito a interpretare un ex spia senile nella commedia d'azione "RED" (2010), tanto da tornare per il sequel, "RED 2" (2013), ma non prima di aver giocato con dei robot giganti in "Transformers: Dark of the Moon" (2011). Dopo aver interpretato un ruolo secondario nei panni di un uomo mite che cerca di sopravvivere a un evento apocalittico molto intricato nel sorprendente successo horror di Netflix "Bird Box" (2018), Malkovich è stato visto più recentemente nei panni del leggendario detective Hercule Poirot nell'adattamento in miniserie di "The A.B.C. Murders" di Agatha Christie (BBC, 2019), così come in un'altra produzione horror di Netflix, "Velvet Buzzsaw" (2019), questa volta ambientata nel mondo dell'arte di Los Angeles.