Malkovich nació en Christopher, Illinois, y creció en Benton, Illinois. Su padre, Daniel Leon Malkovich, fue director estatal de conservación y editor de Outdoor Illinois, una revista sobre conservación. Su madre, Joe Anne, era propietaria del Benton Evening News, así como de Outdoor Illinois.
En 1976, Malkovich, junto con Joan Allen, Gary Sinise y Glenne Headly, se convirtió en miembro fundador de la compañía teatral Steppenwolf de Chicago. En 1980 se mudó a Nueva York para participar en una producción de Steppenwolf de la obra de Sam Shepard, True West, por la que ganó un premio Obie.
A principios de 1982, participó en la obra Un tranvía llamado deseo con el Wisdom Bridge Theatre de Chicago. Posteriormente, dirigió una coproducción de Steppenwolf, la reposición de Balm in Gilead de Lanford Wilson en 1984, por la que recibió su segundo premio Obie y un premio Drama Desk. Ese mismo año debutó en Broadway como Biff en Muerte de un viajante, junto a Dustin Hoffman como Willy. Malkovich ganó un premio Emmy por este papel cuando la obra fue adaptada para televisión por CBS en 1985.
Debutó en el cine en 1984 interpretando al Sr. Will, el inquilino ciego de Sally Field, en la película «Un lugar en el corazón». Por su interpretación del Sr. Will, Malkovich recibió su primera nominación al Óscar como Mejor Actor de Reparto. También interpretó a Al Rockoff en «Los gritos del silencio».
Continuó trabajando de forma constante en películas como El imperio del sol, dirigida por Steven Spielberg, y la adaptación cinematográfica de 1987 de El zoo de cristal de Tennessee Williams, con Paul Newman y Joanne Woodward.
Malkovich protagonizó la adaptación cinematográfica de 1992 de la premiada novela corta de John Steinbeck, De ratones y hombres, interpretando a Lennie junto a Gary Sinise como George. En 1994, fue nominado a otro Óscar, en la misma categoría, por En la línea de fuego. Aunque interpretó el papel principal en Cómo ser John Malkovich, escrita por Charlie Kaufman, su personaje era una ligera variación de sí mismo, como lo indica su segundo nombre: "Horatio".
Malkovich dio entonces un giro radical hacia la ciencia ficción, interpretando a Humma Kavula en la esperada adaptación cinematográfica de la novela clásica de Douglas Adams, "La guía del autoestopista galáctico" (2005), para luego virar hacia la comedia negra, interpretando a un pomposo analista de la CIA, a menudo borracho, que se ve envuelto en un descabellado plan de extorsión en la controvertida película de los hermanos Coen, "Quémate después de leer" (2008).
Es evidente que disfrutó interpretando a un exespía senil en la comedia de acción "RED" (2010), tanto que regresó para la secuela, "RED 2" (2013), pero no sin antes jugar con algunos robots gigantes en "Transformers: Dark of the Moon" (2011). Después de asumir un papel secundario como un hombre de modales suaves que intenta sobrevivir a un evento apocalíptico muy complicado en el éxito de terror sorpresa de Netflix "Bird Box" (2018), Malkovich pudo ser visto más recientemente interpretando al legendario detective Hercule Poirot en una miniserie adaptación de "The A.B.C. Murders" de Agatha Christie (BBC, 2019), así como en otra propuesta de terror de Netflix, "Velvet Buzzsaw" (2019), esta vez ambientada en el mundo del arte de Los Ángeles.