Malkovich wurde in Christopher, Illinois, geboren und wuchs in Benton, Illinois, auf. Sein Vater, Daniel Leon Malkovich, war Naturschutzbeauftragter des Bundesstaates und Herausgeber der Naturschutzzeitschrift „Outdoor Illinois“. Seine Mutter, Joe Anne, war Eigentümerin der „Benton Evening News“ sowie von „Outdoor Illinois“.
1976 wurde Malkovich zusammen mit Joan Allen, Gary Sinise und Glenne Headly Gründungsmitglied der Steppenwolf Theatre Company in Chicago. 1980 zog er nach New York, um in einer Steppenwolf-Produktion von Sam Shepards Stück „True West“ mitzuwirken, wofür er einen Obie Award gewann.
Anfang 1982 spielte er in „Endstation Sehnsucht“ am Wisdom Bridge Theatre in Chicago. Anschließend inszenierte Malkovich eine Steppenwolf-Koproduktion, die Wiederaufnahme von Lanford Wilsons „Balsam in Gilead“ im Jahr 1984, für die er einen zweiten Obie Award und einen Drama Desk Award erhielt. Sein Broadway-Debüt gab er im selben Jahr als Biff in „Tod eines Handlungsreisenden“ an der Seite von Dustin Hoffman als Willy. Für diese Rolle gewann Malkovich einen Emmy Award, als das Stück 1985 von CBS für das Fernsehen adaptiert wurde.
Sein Spielfilmdebüt gab er 1984 als Sally Fields blinder Untermieter Mr. Will in „Ein Platz im Herzen“. Für seine Darstellung des Mr. Will erhielt Malkovich seine erste Oscar-Nominierung als Bester Nebendarsteller. Er spielte außerdem Al Rockoff in „The Killing Fields“.
Er hatte weiterhin regelmäßige Arbeit in Filmen wie Empire of the Sun unter der Regie von Steven Spielberg und der 1987 erschienenen Verfilmung von Tennessee Williams' The Glass Menagerie mit Paul Newman und Joanne Woodward.
Malkovich spielte 1992 in der Verfilmung von John Steinbecks preisgekrönter Novelle „Von Mäusen und Menschen“ die Rolle des Lennie an der Seite von Gary Sinise als George. 1994 wurde er in derselben Kategorie für „In the Line of Fire“ erneut für einen Oscar nominiert. Obwohl er in dem von Charlie Kaufman geschriebenen Film „Being John Malkovich“ die Titelrolle verkörperte, spielte er eine leicht abgewandelte Version seiner selbst, was sich bereits im zweiten Vornamen der Figur, „Horatio“, widerspiegelt.
Malkovich wandte sich dann dem Science-Fiction-Genre zu und spielte Humma Kavula in der lang erwarteten Verfilmung von Douglas Adams' Klassiker "Per Anhalter durch die Galaxis" (2005). Anschließend wechselte er zur schwarzen Komödie und verkörperte einen aufgeblasenen, oft betrunkenen CIA-Analysten, der in dem höchst umstrittenen Film "Burn After Reading" (2008) der Coen-Brüder in eine aberwitzige Erpressungsaffäre verwickelt wird.
Er hatte sichtlich Spaß daran, einen senilen Ex-Spion in der Actionkomödie „RED“ (2010) zu spielen, so sehr, dass er für die Fortsetzung „RED 2“ (2013) zurückkehrte – allerdings nicht, bevor er in „Transformers: Dark of the Moon“ (2011) mit riesigen Robotern herumexperimentierte. Nach einer Nebenrolle als sanftmütiger Mann, der in dem überraschend erfolgreichen Netflix-Horrorfilm „Bird Box“ (2018) ein äußerst verworrenes apokalyptisches Ereignis zu überleben versucht, war Malkovich zuletzt als legendärer Detektiv Hercule Poirot in der Miniserien-Adaption von Agatha Christies „Die Morde des ABC“ (BBC, 2019) sowie in einem weiteren Netflix-Horrorfilm, „Velvet Buzzsaw“ (2019), zu sehen, der diesmal in der Kunstszene von Los Angeles spielt.